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English| 發(fā)布日期：2019-07-01 |
【關(guān)鍵詞】: 熒光光譜儀，激發(fā)光譜
熒光光譜基本原理
一、概念
1.熒光：物質(zhì)的分子吸收了照射光的能量后，處于基態(tài)最低能級(jí)的分子被激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)。被激發(fā)的分子與周圍的分子碰撞，并把部分能量以熱能的形式傳給周圍的分子，自己降落到單線第二電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。然后，由此最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)躍遷，同時(shí)以發(fā)光的形式釋放出其能量。這種光即為熒光。
2.激發(fā)：基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；躍遷一次到位。
3.失活：激發(fā)態(tài) →基態(tài)：多種途徑和方式；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)。
4.熒光條件：它吸收光子發(fā)生多重性不變的
5.吸收光譜：化合物的吸收光強(qiáng)與入射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線
6.激發(fā)光譜：讓不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)熒光物質(zhì)使之發(fā)生熒光，而讓熒光通過固定波長(zhǎng)的發(fā)射單色器照射到檢測(cè)器上，檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化。
7.發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長(zhǎng)(一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位),掃描出的化合物的發(fā)射光強(qiáng)(熒光/磷光) 與發(fā)射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。
二、工作原理
（一）激發(fā)光譜和熒光光譜
任何發(fā)射熒光的物質(zhì)都具有兩個(gè)特征光譜，即激發(fā)光譜（excitation spectrum）和熒光光譜(fluorescence spectrum)。激發(fā)光譜：將激發(fā)光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長(zhǎng)，固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度的變化。激發(fā)光譜和熒光光譜是熒光分析中定性和定量的基礎(chǔ)。
以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長(zhǎng)λex。
熒光光譜：用最強(qiáng)激發(fā)波長(zhǎng)λex作激發(fā)光源，并固定強(qiáng)度，而讓物質(zhì)發(fā)射的熒光通過單色器分光，測(cè)定不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度。熒光物質(zhì)的λex和λem是鑒定物質(zhì)的依據(jù)，也是定量測(cè)定中所選用的最靈敏的波長(zhǎng)。
以熒光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，便得熒光光譜。熒光強(qiáng)度最強(qiáng)時(shí)的波長(zhǎng)稱為最大發(fā)射波長(zhǎng)λem 。
（二）熒光分析的特點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（可達(dá)10～12個(gè)數(shù)量級(jí)）；選擇性強(qiáng)，有利于分析復(fù)雜的多組分混合物；用樣量少、特異性好、操作簡(jiǎn)便。
缺點(diǎn)：對(duì)溫度、pH值等因素變化比較敏感；應(yīng)用范圍較窄，只能用來測(cè)量發(fā)熒光的物質(zhì)，或與某些試劑作用后發(fā)熒光的物質(zhì)。
三、熒光光譜儀的主要結(jié)構(gòu)
激發(fā)光源：用來激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，可以用鹵鎢燈、氙燈、汞燈、氙-汞弧燈、激光器以及閃光燈等，最常用的是氙燈。
單色器：分離出所需要的單色光。熒光光譜儀有兩個(gè)單色器，一是激發(fā)單色器，用于將入射的激發(fā)光變成單色光；二是發(fā)射單色器，用于將發(fā)射的熒光變成單色光。
樣品池：放置測(cè)試樣品，用石英做成。
檢測(cè)器：接受光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。
記錄顯示系統(tǒng)：檢測(cè)器出來的電信號(hào)經(jīng)過放大器放大后，由記錄儀記錄下來，并可數(shù)字顯示。
四、熒光光譜儀的性能指標(biāo)：
熒光光譜儀的性能指標(biāo)主要包括：靈敏度、波長(zhǎng)范圍、波長(zhǎng)精度、分辨率、光譜帶寬、信噪比。
1.靈敏度
靈敏度是指能被儀器檢出的最低信號(hào)，或某一標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)稀溶液在選定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下能檢出的最低濃度，是儀器最重要的性能指標(biāo)之一。
多數(shù)熒光光譜儀的靈敏度較高，可達(dá)10-10g~10-12g水平，有利于檢測(cè)體液中的微量物質(zhì)。
2.波長(zhǎng)范圍
波長(zhǎng)范圍指熒光光譜儀的有效工作波段，包括激發(fā)通道波長(zhǎng)范圍、投射通道波長(zhǎng)范圍和熒光通道波長(zhǎng)范圍。波長(zhǎng)范圍越大，應(yīng)用范圍越廣。
一般熒光分光光度計(jì)都采用氙燈作光源，光柵為單色器分光元件，其有效工作波段在200nm～1000nm范圍之內(nèi)。
3.波長(zhǎng)精度
指其波長(zhǎng)計(jì)數(shù)器的指示值與真實(shí)光波長(zhǎng)的數(shù)值相符的程度。
特定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)是定性分析和定量測(cè)定的基礎(chǔ)，因此波長(zhǎng)精度也是熒光光譜儀的核心指標(biāo)之一。目前熒光分光光度計(jì)的波長(zhǎng)精度誤差在±（0.2nm～2nm）范圍之內(nèi)。
4.分辨率
指熒光儀器對(duì)靠近的峰尖分開的能力，它與波長(zhǎng)精度有密切關(guān)系，決定著對(duì)混合物成分分析特異性的好壞。常用儀器的分辨率在0.2nm～5nm之間，主要由光柵的每毫米刻線數(shù)決定。
5.光譜帶寬
指儀器主機(jī)狹縫寬窄程度的指數(shù)。
以一定狹縫幾何密度對(duì)應(yīng)的光譜半寬度來直接表示光譜純度。光譜純度直接影響儀器的分辨率、靈敏度以及背景干擾。目前的熒光分光光度計(jì)的光譜帶寬在0.15nm～20nm之間，一般都采用連續(xù)可調(diào)方式。
6.信噪比與響應(yīng)速度
用空白樣品測(cè)得的峰值叫做噪聲峰值，待測(cè)樣品測(cè)得的峰值和噪聲峰值之比就叫做信噪比。信噪比越高，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性也越高。
儀器的響應(yīng)速度是指電路樣品通道對(duì)光電信號(hào)反映的快慢。響應(yīng)速度關(guān)系到波長(zhǎng)掃描速度的選擇、光譜峰的尖銳程度以及隨機(jī)噪聲的大小。
五、熒光光譜儀應(yīng)用
熒光光譜儀被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、環(huán)境和生物化學(xué)領(lǐng)域。是研究小分子與核酸相互作用的主要手段。通過藥物與核酸相互作用，使DNA與探針鍵合的程度減小，反映在探針熒光光譜的改變，從而可以了解藥物和核酸的作用機(jī)理。
熒光光譜儀是研究藥物與蛋白質(zhì)相互作用的常用儀器。藥物與蛋白質(zhì)相互作用后可能引起藥物自身熒光光譜和蛋白質(zhì)自身熒光(內(nèi)源熒光)光譜以及同步熒光光譜的變化，如熒光強(qiáng)度和偏振度的改變、新熒光峰的出現(xiàn)等，這些均可以提供藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的信息。
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